Учебник для ВУЗОВ

БИОХИМИЯ

>>> Перейти на полный размер сайта >>>

       

Е. Использование ДНК-технологий для получения лекарственных препаратов и лечения различных болезней

Вакцины — очищенные белки, антигенные детерминанты ряда возбудителей вирусных и бактериальных инфекций. В последнее время их получают, пользуясь техникой рекомбинантных ДНК. Первой вакциной, синтезированной этим способом, была вакцина против вируса гепатита В.

Белки, имеющие терапевтическое значение, получают с использованием этой технологии во многих странах мира. Так, одним из первых синтезирован инсулин человека (рис. 4-70). В клетках Е. coli, трансформированных плазмидами, содержащими ДНК, которая кодировала А- и В-цепи инсулина, нарабатывают белковые продукты А- и В-цепей. После очистки их подвергают фолдингу и окислению, которое обеспечивает образование соответствующих дисульфидных мостиков.

Рис. 4-70. Получение инсулина человека в клетках Е. coli. 1 — трансформация клеток Е. coli плазмидами, которые содержат гены, кодирующие структуру А- и В-цепей инсулина; 2 — синтез А- и В-цепей инсулина в процессе выращивания культуры трансформированных клеток Е. coli; 3 — выделение и очистка А- и В-цепей инсулина; 4 — пространственная укладка А- и В-цепей инсулина и окисление остатков цистеина

Аналогичным способом получен гормон роста, используемый для лечения детей с недостаточностью этого гормона. Более сложные белки получены в культуре клеток млекопитающих. Так, дефекты в гене фактора VIII, кодирующего один из белков — участников свёртывающей системы крови, ответственны за возникновение гемофилии. До того как фактор VIII был получен методами генной инженерии, большое количество больных погибало от СПИДа или гепатита, которыми они заражались в результате введения выделенного из крови фактора VIII или переливания крови от доноров, являвшихся носителями этих болезней.

Тканевый активатор плазминогена (ТАЛ) — протеаза, участвующая в процессе фибринолиза и предотвращающая образование тромбов в кровеносном русле; получена с помощью рекомбинантных ДНК. ТАП назначают больным с ишемической болезнью сердца для ускорения растворения тромбов, которые могут вызвать закупорку коронарных артерий и нарушить поступление кислорода в миокард.

Осуществлено получение рекомбинантных факторов роста, обеспечивающих восстановление гемостаза: эритропоэтина, интерлейкинов, колоний-стимулирующих факторов. Эти препараты используют в лечении больных анемией, после трансплантации костного мозга или химиотерапии, чтобы стимулировать образование клеток крови и снизить риск иммунодефицита. Разработаны методы получения белков человека с использованием трансгенных животных; эти белки получают в результате искусственного введения чужеродного гена в оплодотворённую яйцеклетку или в ранние зародыши млекопитающих (рис. 4-71). Генноинженерные мероприятия можно провести таким образом, чтобы интересующий нас белок человека секретиро-вался с белками молока.

Рис. 4-71. Использование трансгенных животных для получения белков человека. Ген человека встраивают в вектор таким образом, чтобы он был под контролем β-лактоглобинового промотора, который активен только в клетках молочной железы. Присутствие у трансгенного потомства гена человека контролировали с помощью метода ПЦР, в которой использовали праймеры к гену человека. При фракционировании белков молока получают белковый продукт экспрессии гена человека

Генная терапия — лечение наследственных, многофакторных и инфекционных заболеваний путём введения в соматические клетки пациентов генов, которые обеспечивают исправление генных дефектов или придают клеткам новые функции.

Первый клинический опыт применения генной терапии был осуществлён в 1990 г. в Бетесде (США) на четырёхлетней девочке, страдавшей наследственным иммунодефицитом, вызванным мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). Ребёнку были введены её собственные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма генной конструкцией, включающей ген ADA + ген пео + ретровирусный вектор. Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедуру введения гена повторяли многократно без видимых неблагоприятных эффектов.

Для успешной генотерапии необходимо:

  • обеспечить эффективную доставку чужеродного гена в клетки-мишени;
  • создать условия для длительной экспрессии гена в этих клетках.

К настоящему времени разработаны химические, физические и биологические методы доставки чужеродного гена в клетки-мишени. Однако пока только вирусные векторы или генетические конструкции, включающие вирусные последовательности, способны к эффективной доставке необходимого гена и его последующей длительной экспрессии. В результате из более чем 175 уже одобренных протоколов клинических испытаний по генотерапии более 120 основаны на применении ретровирусных векторов.

В геном пациента чужеродная ДНК может вводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организм больного (in vivo). При осуществлении первого способа выделяют и культивируют специфический тип клеток пациента, вводят в него чужеродный ген, отбирают трансформированные клетки и реинфузируют их тому же больному (рис. 4-72).

Рис. 4-72. Введение чужеродного гена ex vivo (А) и in vivo (Б). А. Введение чужеродного «лечебного» гена в организм больного в составе клеток, содержащих этот ген. Б. Введение «лечебного» гена в составе конструкции, содержащей: ДНК, включающую этот ген; белок (например асиалогликопротеин), взаимодействующий с соответствующим рецептором на мембране клеток; вирусный вектор (аденовирус), обеспечивающий длительную экспрессию «лечебного» гена

Генная терапия in vivo основана на прямом введении в специализированные ткани больного клонированных и определённым образом упакованных последовательностей ДНК, поступающих с помощью рецепторов в определённые типы клеток. В этом способе гены вводят, как правило, в виде аэрозольных и инъецируемых форм. Наиболее часто аэрозольную генотерапию используют при лечении болезней лёгких (например, раке лёгких) и муковисцидоза.

Наряду с развитием исследований, касающихся лечения наследственных дефектов, генотерапию всё чаще используют для лечения ненаследственных, главным образом, инфекционных и онкологических болезней (см. раздел 16).

Единственное и непременное ограничение таких работ состоит в том, чтобы все генотерапевтические мероприятия были направлены на конкретного больного и затрагивали только его соматические клетки.

Современный уровень знаний не позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровне половых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей человека в связи с реальной опасностью засорения генофонда нежелательными генными конструкциями и внесения мутаций с непредсказуемыми результатами.

В целях предотвращения распространения дефектных генов в популяции людей и рождения детей с наследственными патологиями во многих странах мира работают генетические консультанты, а также проводят пренатальную диагностику, позволяющую оценить здоровье плода с использованием анализа ДНК на самых ранних стадиях развития.

 

 

Top.Mail.Ru
Top.Mail.Ru