Учебник для ВУЗОВ

БИОХИМИЯ

>>> Перейти на полный размер сайта >>>

       

Д. ДНК-диагностика заболеваний

Используя технику рекомбинантных ДНК, удаётся исследовать варианты генов, ответственных за развитие многих заболеваний. Этим способом идентифицированы точечные мутации, вызванные заменой одного азотистого основания, делениями или вставками, приводящими к появлению аллелей, кодирующих функционально неактивные белки. Дефектные «полиморфы» возникают как за счёт изменений в кодирующих участках гена, так и в результате мутаций в некодирующих областях, тесно примыкающих к генам и вызывающих нарушение их работы.

Разработанные технологии позволяют вести целенаправленное картирование генов человека в рамках международного проекта «Геном человека». Официально эта научная программа с участием ведущих молекулярно-генетических лабораторий США, стран Западной Европы, а также России и Японии оформилась в 1990 г. В ходе работы над проектом картированы 923 гена, вызывающих развитие моногенных заболеваний, более 100 из них полностью секве-нированы. К концу 2001 г. работами лабораторий США, Великобритании, Японии и ряда европейских стран с точностью до 90% завершена расшифровка генома. Ожидается, что в течение ближайших 2—3 лет будут изучены все гены, ответственные за развитие патологических процессов у человека. Это позволит вывести диагностику и лечение многих болезней на новый уровень.

Остановимся на некоторых методах, широко используемых для идентификации моногенных болезней.

1. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

Мутации, возникающие в участках узнавания определённых рестриктаз, делают эти участки ДНК нечувствительными к действию ферментов. Это может быть легко обнаружено по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК. ПДРФ-анализ включает следующие этапы: выделение геномной ДНК, её рестрикцию специфической эндонуклеазой, электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и идентификацию этих фрагментов путём блот-гибридизации по Саузерну. На электрофо-реграммах при отсутствии рестрикции в исследуемой ДНК выявляют один крупный фрагмент, соответствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними участками рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном участке на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным участком рестрикции и одним из ближайших постоянных участков рестрикции (рис. 4-68).

Рис. 4-68. Рестрикционный анализ ДНК гемоглобина человека, больного серповидно-клеточной анемией (HbS). Миссенс-мутация, ответственная за возникновение серповидно-клеточной анемии, связана с заменой в гене β-цепи глобина триплета GAG на GTG. При этом утрачивается участок рестрикции фермента Mstll, узнающего последовательность CCTNAGG, где N может быть любым основанием. При наличии мутации генный зонд гибридизуется с более крупным фрагментом ДНК размером 1,3 килобазы, имеющим при электрофорезе меньшую подвижность, чем продукт рестрикции нормального гена, длина которого равна 1,1 килобазы

ПДРФ-анализ может быть значительно упрощён в том случае, если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путём проведения ПЦР и рестрикции амплифициро-ванного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки рестриктазой. Если участок узнавания не изменён, обработка ферментом приведёт к образованию 2 маленьких фрагментов с той же суммарной длиной, что и исходный фрагмент.

При обследовании пациентов и членов их семей на носительство патологических генов широко используют этот метод, с помощью которого:

  • идентифицируют делеции в гене дистрофи-на, на долю которых приходится около 60% всех мутаций, вызывающих миодистрофию Дюшенна;
  • диагностируют гемофилию А, некоторые талассемии, ретинобластому и гранулематоз;
  • контролируют здоровье детей в семьях, в которых родители являются гетерозиготами по гену серповидно-клеточной анемии и другим дефектным генам.

2. Определение мутаций с помощью аллельспецифических проб

Многие мутации, вызывающие возникновение генных болезней, не попадают в участки, ответственные за узнавание ферментов рестрикции. В этом случае, если последовательность оснований в области мутации известна, то её обнаруживают с помощью аллель-специфических олигонуклеотидов. Для этого синтезируют короткие олигонуклеотидные зонды, содержащие обычно около 19 нуклеотидов, комплементарные участку нормального и мутантного аллеля в ДНК. Область генома, содержащую исследуемый ген, амгошфицируют с помощью ПЦР, и образцы полученной ДНК переносят на нитроцеллюлозные фильтры (дот- или слот-блоттинг). Пробы выдерживают с 32Р-зондами для выявления нормальной или мутантной последовательности. У гомозигот по исследуемой мутации ДНК будет гибридизоваться только с зондом, комплементарным мутантной последовательности. ДНК нормального гомозиготного индивидуума свяжется с зондом, соответствующим неизменённой нуклеотидной последовательности, тогда как с ДНК гетерозигот будут гибридизоваться оба зонда. На рисунке 4-69 представлены результаты генного зондирования 7 пациентов на носительство наиболее часто встречающейся делеции 3 нуклеотидов (ΔF508) в гене, ответственном за развитие муковисцидоза.

Рис. 4-69. Генное зондирование на носительство муко-висцидоза. С помощью ПЦР амплифицируют геномную ДНК, и продукт переносят на 2 нейлоновых фильтра, один из которых гибридизуют с 32Р-зондом на нормальный аллель, а второй с 32Р-зондом на мутантный аллель ΔF508. Образование гибридов обнаруживают радиоавтографически. Пробы 1-3 служили контролями: первая содержала продукты ПЦР ДНК от гомозигот по нормальному гену; вторая — от гетерозиготного носителя мутации ΔF508; третья — от больного муковисцидозом, гомозиготного по мутации ΔF508. Пробы 4-10 получены при обследовании 7 пациентов на носительство ΔF508: 4, 5, 6 и 9 оказались гомозиготами по нормальному гену, а 7, 8 и 10 — гетерозиготными носителями мутантного гена

Олигонуклеотиды, аллель-специфичные по определённым мутациям, можно использовать в качестве праймеров в ПЦР при клиническом тестировании населения на наличие патологического гена. Если ДНК, полученная от пациента, амплифицирует с мутантным олигонуклеотидом, то следовательно пациент является носителем мутации. Если нуклеотидная последовательность в исследуемом гене не изменена, то олигонуклеотид, содержащий мутацию, не свяжется с ДНК-матрицей, и ПЦР не пойдёт.

 

 

Top.Mail.Ru
Top.Mail.Ru