А. Регуляция активности генов у прокариотов. Теория оперона
Исследования на клетках Е. coli позволили установить, что у бактерий существуют ферменты 3 типов:
конститутивные, присутствующие в клетках в постоянных количествах независимо от метаболического состояния организма (например, ферменты гликолиза);
индуцируемые, их концентрация в обычных условиях мала, но может возрастать в 1000 раз и более, если, например, в среду культивирования клеток добавить субстрат такого фермента;
репрессируемые, т.е. ферменты метаболических путей, синтез которых прекращается при добавлении в среду выращивания конечного продукта этих путей.
1. Теория оперона
На основании генетических исследований индукции β-галактозидазы, участвующей в клетках Е. coli, в гидролитическом расщеплении лактозы (рис. 4-46), Франсуа Жакоб и Жак Моно в 1961 г. сформулировали гипотезу оперона, которая объясняла механизм контроля синтеза белков у прокариотов.
Рис. 4-46. Гидролиз лактозы β-галактозидазой.
В экспериментах гипотеза оперона получила полное подтверждение, а предложенный в ней тип регуляции стали называть контролем синтеза белка на уровне транскрипции, так как в этом случае изменение скорости синтеза белков осуществляется за счёт изменения скорости транскрипции генов, т.е. на стадии образования мРНК.
У Е. coli, как и у других прокариотов, ДНК не отделена от цитоплазмы ядерной оболочкой. В процессе транскрипции образуются первичные транскрипты, не содержащие интронов, а мРНК лишены «кэпа» и поли-А-конца. Синтез белка начинается до того, как заканчивается синтез его матрицы, т.е. транскрипция и трансляция протекают почти одновременно. Исходя из размера генома (4x106 пар нуклеотидов), каждая клетка Е. coli содержит информацию о нескольких тысячах белков. Но при нормальных условиях роста она синтезирует около 600-800 различных белков, а это означает, что многие гены не транскрибируются, т.е. неактивны. Гены белков, функции которых в метаболических процессах тесно связаны, часто в геноме группируются вместе в структурные единицы (опероны).
Согласно теории Жакоба и Моно, оперонами называют участки молекулы ДНК, которые содержат информацию о группе функционально взаимосвязанных структурных белков, и регуляторную зону, контролирующую транскрипцию этих генов. Структурные гены оперона экспрессируются согласованно, либо все они транскрибируются, и тогда оперон активен, либо ни один из генов не «прочитывается», и тогда оперон неактивен. Когда оперон активен и все его гены транскрибируются, то синтезируется полицистронная мРНК, служащая матрицей для синтеза всех белков этого оперона. Транскрипция структурных генов зависит от способности РНК-полимеразы присоединяться к промотору, расположенному на 5'-конце оперона перед структурными генами.
Связывание РНК-полимеразы с промотором зависит от присутствия белка-репрессора на смежном с промотором участке, который называют «оператор». Белок-репрессор синтезируется в клетке с постоянной скоростью и имеет сродство к операторному участку. Структурно участки промотора и оператора частично перекрываются, поэтому присоединение белка-репрессора к оператору создаёт стерическое препятствие для присоединения РНК-полимеразы.
Большинство механизмов регуляции синтеза белков направлено на изменение скорости связывания РНК-полимеразы с промотором, влияя таким образом на этап инициации транскрипции. Гены, осуществляющие синтез регуляторных белков, могут быть удалены от оперона, транскрипцию которого они контролируют.
2. Индукция синтеза белков. Lac-оперон
Теория оперона была предложена на основании данных, полученных при изучении свойств лактозного оперона (lac-оперона) Е. coli, т.е. оперона, в котором закодированы белки, участвующие в усвоении лактозы.
Клетки Е. coli обычно растут на среде, используя в качестве источника углерода глюкозу. Если в среде культивирования глюкозу заменить на дисахарид лактозу, то по прошествии нескольких минут клетки адаптируются к изменившимся условиям. Они начинают продуцировать 3 белка, обеспечивающих утилизацию лактозы. Один из этих белков — фермент β-галактозидаза, катализирующий гидролитическое расщепление лактозы до глюкозы и галактозы.
В присутствии глюкозы клетки Е. coli содержат менее 10 молекул этих ферментов на клетку. Перенос клеток на среду, содержащую лактозу, вызывает индукцию — увеличение количества молекул каждого из ферментов до 5000 (рис. 4-47).
Рис. 4-47. Механизм индукции лактозного оперона. А - в отсутствие индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором. РНК-полимераза не может присоединиться к промотору, транскрипция структурных генов оперона не идёт; Б - в присутствии лактозы белок-репрессор присоединяет её, изменяет свою конформацию и теряет сродство к оператору. РНК-полимераза связывается с промотором и транскрибирует структурные гены: β-галактозидазы (А), катализирующей гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы; галактозидпермеазы (В), осуществляющей транспорт лактозы и других галактозидов в клетки; тиогалакто-зидтрансацетилазы (С) — фермента, способного переносить ацетильную группу ацетил-КоА на тиогалактозу. Функция его в процессе утилизации лактозы пока неясна
Теория оперона объясняет это явление следующим образом. В отсутствие индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором. А поскольку участки оператора и промотора перекрываются, то присоединение репрессора к оператору препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором, и транскрипция структурных генов оперона не идёт. Когда в среде появляется индуктор, т.е. лактоза, то он присоединяется к белку-репрессору, изменяет его конформацию и снижает сродство к оператору. РНК-полимераза связывается с промотором и транскрибирует структурные гены.
3. Репрессия синтеза белков. Триптофановый и гистидиновый опероны
Снижение концентрации фермента в бактериальной клетке может осуществляться путём репрессии синтеза ферментов. Сущность этого механизма регуляции заключается в следующем: когда клетки Е. coli растут на среде, содержащей в качестве единственного источника азота соль аммония, то им приходится синтезировать все азотсодержащие вещества. Такие клетки, в частности, должны содержать все ферменты, необходимые для синтеза 20 различных аминокислот. Однако если добавить в среду культивирования одну из аминокислот, например триптофан или гистидин, то клетка перестанет вырабатывать весь набор ферментов, необходимых для синтеза этих аминокислот из аммиака и источника углерода. Репрессия синтеза ферментов, катализирующих последовательность реакций метаболического пути конечным продуктом, как это имеет место в случае ферментов синтеза гистидина или триптофана, называется репрессией конечным продуктом.
Это явление теория оперона объясняет следующим образом: при отсутствии в среде Гис или Три регуляторный белок-репрессор не имеет сродства к оператору и происходит синтез ферментов, осуществляющих образование этих аминокислот. Когда в среду добавляют, например, Гис, то эта небольшая молекула, получившая название «корепрессор», присоединяется к белку-репрессору. В результате конформационных изменений в молекуле репрессора комплекс бел-ка-репрессора и корепрессора (Гис) приобретает сродство к оператору, присоединяется к нему, и транскрипция оперона прекращается, т.е. прекращается считывание информации о строении 10 ферментов, участвующих в синтезе этой аминокислоты (рис. 4-48).
Рис. 4-48. Механизм репрессии синтеза ферментов, участвующих в образовании гистидина. А - в отсутствие корепрессора (гистидина) белок-репрессор не имеет сродства к оператору, РНК-полимераза присоединяется к промотору, и происходит транскрипция 10 структурных генов, кодирующих строение ферментов, участвующих в синтезе гистидина; Б - в присутствии гистидина в среде комплекс бел ка-реп рессора с корепрессором, т.е. Гис, связывается с оператором, препятствует присоединению РНК-полимеразы к промотору и останавливает транскрипцию
Следует иметь в виду, что репрессия и индукция синтеза белков у прокариотов реализуют принципы адаптации к меняющимся условиям существования и клеточной экономии: ферменты появляются в клетках, когда в них существует потребность, и перестают вырабатываться, если потребность исчезает.
