Г. Зависимость скорости ферментативной реакции от количества субстрата
Если концентрацию ферментов оставить постоянной, изменяя только количество субстрата, то график скорости ферментативной реакции описывают гиперболой (рис. 2-19).
Рис. 2-19. Зависимость скорости реакции (V) от концентрации субстрата S. Vmax — максимальная скорость реакции при данной концентрации фермента в оптимальных условиях проведения реакции. Кm — константа Михаэлиса
При увеличении количества субстрата начальная скорость возрастает. Когда фермент становится полностью насыщенным субстратом, т.е. происходит максимально возможное при данной концентрации фермента формирование фермент-субстратного комплекса, наблюдают наибольшую скорость образования продукта. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению образования продукта, т.е. скорость реакции не возрастает. Данное состояние соответствует максимальной скорости реакции Vmax.
Таким образом, концентрация фермента — лимитирующий фактор в образовании продукта. Это наблюдение легло в основу ферментативной кинетики, разработанной учёными Л. Михаэлисом и М. Ментен в 1913 г.
Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:
где k1 — константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k-1 — константа скорости обратной реакции, распада фермент-субстратного комплекса; k2 — константа скорости образования продукта реакции.
Следующее соотношение констант скоростей (k-1 + k2)/k1 называют константой Михаэлиса и обозначают Кm.
Скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса ES, а скорость образования ES зависит от концентрации субстрата и концентрации свободного фермента. На концентрацию ES влияет скорость формирования и распада ES.
Наибольшая скорость реакции наблюдается в том случае, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом, т.е. в фермент-субстратном комплексе ES, т.е. [Е] = [ES].
Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается следующим уравнением (математическое выведение этой формулы можно найти в пособиях по ферментативной кинетике):
Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса—Ментен.
В случае, когда скорость реакции равна половине максимальной, Km = [S] (рис. 2-19). Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости.
Уравнение Михаэлиса—Ментен — основное уравнение ферментативной кинетики, описывающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.
Если концентрация субстрата значительно больше Km (S >> Km), то увеличение концентрации субстрата на величину Кm практически не влияет на сумму (Km + S) и её можно считать равной концентрации субстрата. Следовательно, скорость реакции становится равной максимальной скорости: V = Vmax. В этих условиях реакция имеет нулевой порядок, т.е. не зависит от концентрации субстрата. Можно сделать вывод, что Vmax — величина постоянная для данной концентрации фермента, не зависящая от концентрации субстрата.
Если концентрация субстрата значительно меньше Km(S << Km), то сумма (Km + S) примерно равна Кm, следовательно, V = Vmax[S]/Km, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).
Vmax и Кm — кинетические характеристики эффективности фермента.
Vmax даёт характеристику каталитической активности фермента и имеет размерность скорости ферментативной реакции моль/л, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента и в условиях избытка субстрата.
Кm характеризует сродство данного фермента к данному субстрату и является величиной постоянной, не зависящей от концентрации фермента. Чем меньше Кm, тем больше сродство фермента к данному субстрату, тем выше начальная скорость реакции и наоборот, чем больше Кm, тем меньше начальная скорость реакции, тем меньше сродство фермента к субстрату.
На рис. 2-20 представлена зависимость скорости двух ферментативных реакций (1 и 2) от концентрации субстрата.
Рис. 2-20. Влияние различных концентраций субстрата на скорость реакции, катализируемой ферментами 1 и 2
Константа Михаэлиса первого фермента меньше константы Михаэлиса второго фермента (Km1 < Km2). Следовательно, сродство первого фермента к субстрату выше, чем у второго фермента, и начальная скорость реакции, катализируемой первым ферментом, выше в сравнении со вторым ферментом.
