Учебник для ВУЗОВ

БИОХИМИЯ

I. Механизмы обезвреживания ксенобиотиков

Обезвреживание большинства ксенобиотиков происходит путём химической модификации и протекает в 2 фазы (рис. 12-1). В результате этой серии реакций ксенобиотики становятся более гидрофильными и выделяются с мочой. Вещества, более гидрофобные или обладающие большой молекулярной массой (>300 кД), чаще выводятся с жёлчью в кишечник и затем удаляются с фекалиями.

Рис. 12-1. Метаболизм и выведение ксенобиотиков из организма. RH — ксенобиотик; К — группа, используемая при конъюгации (глутатион, глюкуронил и др.); М — молекулярная масса. Из множества цитохром Р₄₅₀-зависимых реакций на рисунке приведена только одна — схема гидроксилирования ксенобиотика. В ходе первой фазы в структуру вещества RH вводится полярная группа ОН^-. Далее происходит реакция конъюгации; конъюгат в зависимости от растворимости и молекулярной массы удаляется либо почками, либо с фекалиями

Система обезвреживания включает множество разнообразных ферментов, под действием которых практически любой ксенобиотик может быть модифицирован.

Микросомальные ферменты катализируют реакции С-гидроксилирования, N-гидроксилиро-вания, О-, N-, S-дезалкилирования, окислительного дезаминирования, сульфоокисления и эпоксидирования (табл. 12-1).

Таблица 12-1.
Возможные модификации ксенобиотиков в первой фазе обезвреживания

В мембранах ЭР практически всех тканей локализована система микросомального окисления (монооксигеназного окисления). В эксперименте при выделении ЭР из клеток мембрана распадается на части, каждая из которых образует замкнутый пузырёк — микросому, отсюда и название — микросомальное окисление. Эта система обеспечивает первую фазу обезвреживания большинства гидрофобных веществ.

В метаболизме ксенобиотиков могут принимать участие ферменты почек, лёгких, кожи и ЖКТ, но наиболее активны они в печени. К группе микросомальных ферментов относят специфические оксидазы, различные гидролазы и ферменты конъюгации.

Вторая фаза — реакции конъюгации, в результате которых чужеродное вещество, модифицированное ферментными системами ЭР, связывается с эндогенными субстратами — глюкуроновой кислотой, серной кислотой, глицином, глутатионом. Образовавшийся конъюгат удаляется из организма.

А. Микросомальное окисление

Микросомальные оксидазы — ферменты, локализованные в мембранах гладкого ЭР, функционирующие в комплексе с двумя внемитохон-дриальными ЦПЭ. Ферменты, катализирующие восстановление одного атома молекулы O₂ с образованием воды и включение другого атома кислорода в окисляемое вещество, получили название микросомальных оксидаз со смешанной функцией или микросомальных монооксигеназ. Окисление с участием монооксигеназ обычно изучают, используя препараты микросом.

1. Основные ферменты микросомальных электронтранспортных цепей

Микросомальная система не содержит растворимых в цитозоле белковых компонентов, все ферменты — мембранные белки, активные центры которых локализованы на цитоплазматической поверхности ЭР. Система включает несколько белков, составляющих электронтранспортные цепи (ЦПЭ). В ЭР существуют две такие цепи, первая состоит из двух ферментов — NADPH-Р₄₅₀ редук-тазы и цитохрома Р₄₅₀, вторая включает фермент NADH-цитохром-Ь₅ редукгазу, цитохром Ь₅ и ещё один фермент — стеароил-КоА-десатуразу.

Электронтранспортная цепь — NADPH-Р₄₅₀ редуктаза — цитохром Р₄₅₀. В большинстве случаев донором электронов (ё) для этой цепи служит NADPH, окисляемый NADPH-Р₄₅₀-редуктазой. Фермент в качестве простетической группы содержит 2 кофермента — флавинаденинди-нуклеотид (FAD) и флавинмононуклеотид (FMN). Протоны и электроны с NADPH переходят последовательно на коферменты NADPH-Р₄₅₀ редуктазы. Восстановленный FMN (FMNH₂) окисляется цитохромом Р₄₅₀ (см. схему ниже).

Цитохром Р₄₅₀ — гемопротеин, содержит простетическую группу гем и имеет участки связывания для кислорода и субстрата (ксенобиотика). Название цитохром Р₄₅₀ указывает на то, что максимум поглощения комплекса цитохрома Р₄₅₀ лежит в области 450 нм.

Окисляемый субстрат (донор электронов) для NADH-цитохром Ь₅-редуктазы — NADH (см. схему выше). Протоны и электроны с NADH переходят на кофермент редуктазы FAD, следующим акцептором электронов служит Fe³⁺ цитохрома Ь₅. Цитохром Ь₅ в некоторых случаях может быть донором электронов (ё) для цитохрома Р₄₅₀ или для стеароил-КоА-десатуразы, которая катализирует образование двойных связей в жирных кислотах, перенося электроны на кислород с образованием воды (рис. 12-2).

Рис. 12-2. Электронтранспортные цепи ЭР. RH — субстрат цитохрома Р₄₅₀; стрелками показаны реакции переноса электронов. В одной системе NADPH окисляется NADPH цитохром Р₄₅₀-редуктазой, которая затем передаёт электроны на целое семейство цитохромов Р₄₅₀. Вторая система включает в себя окисление NADH цитохром Ь₅-редуктазой, электроны переходят на цитохром Ь5; восстановленную форму цитохрома Ь₅ окисляет стеароил-КоА-десатураза, которая переносит электроны на O₂

NADH-цитохром Ь₅ редуктаза — двухдоменный белок. Глобулярный цитозольный домен связывает простетическую группу — кофермент FAD, а единственный гидрофобный «хвост» закрепляет белок в мембране.

Цитохром Ь₅ — гемсодержащий белок, который имеет домен, локализованный на поверхности мембраны ЭР, и короткий «заякоренный» в липидном бислое спирализованный домен.

NADH-цитохром Ь₅-редукгаза и цитохром Ь₅, являясь «заякоренными» белками, не фиксированы строго на определённых участках мембраны ЭР и поэтому могут менять свою локализацию.

2. Функционирование цитохрома Р₄₅₀

Известно, что молекулярный кислород в трип-летном состоянии инертен и не способен взаимодействовать с органическими соединениями. Чтобы сделать кислород реакционно-способным, необходимо его превратить в синглетный, используя ферментные системы его восстановления. К числу таковых принадлежит моноксиге-назная система, содержащая цитохром Р₄₅₀. Связывание в активном центре цитохрома Р₄₅₀ липофильного вещества RH и молекулы кислорода повышает окислительную активность фермента. Один атом кислорода принимает 2 ё и переходит в форму О_2-. Донором электронов служит NADPH, который окисляется NADPH-цитохром Р₄₅₀ редуктазой. О_2- взаимодействует с протонами: О_2- + 2Н⁺ ↔ Н₂O, и образуется вода. Второй атом молекулы кислорода включается в субстрат RH, образуя гидроксильную группу вещества R-ОН (рис. 12-3).

Рис. 12-3. Транспорт электронов при монооксигеназном окислении с участием Р₄₅₀. Связывание (1) в активном центре цитохрома Р₄₅₀ вещества RH активирует восстановление железа в геме — присоединяется первый электрон (2). Изменение валентности железа увеличивает сродство комплекса Р₄₅₀-Fe²⁺-RH к молекуле кислорода (3). Появление в центре связывания цитохрома Р₄₅₀ молекулы O₂ ускоряет присоединение второго электрона и образование комплекса Р₄₅₀-Fe²⁺O₂^--RH (4). На следующем этапе (5) Fe²⁺ окисляется, второй электрон присоединяется к молекуле кислорода Р₄₅₀-Fe³⁺O₂^-. Восстановленный атом кислорода (О₂-) связывает 2 протона, и образуется 1 молекула воды. Второй атом кислорода идёт на построение ОН-группы (6). Модифицированное вещество R-ОН отделяется от фермента (7)

Суммарное уравнение реакции гидроксили-рования вещества RH ферментами микросомального окисления:

RH + O₂ + NADPH + Н⁺ ↔ ROH + Н₂О + NADP⁺

Субстратами Р₄₅₀ могут быть многие гидрофобные вещества как экзогенного (лекарственные препараты, ксенобиотики), так и эндогенного (стероиды, жирные кислоты и др.) происхождения.

Таким образом, в результате первой фазы обезвреживания с участием цитохрома Р₄₅₀ происходит модификация веществ с образованием функциональных групп, повышающих растворимость гидрофобного соединения. В результате модификации возможна потеря молекулой её биологической активности или даже формирование более активного соединения, чем вещество, из которого оно образовалось.

3. Свойства системы микросомального окисления

Важнейшие свойства ферментов микросомального окисления: широкая субстратная специфичность, которая позволяет обезвреживать самые разнообразные по строению вещества, и регуляция активности по механизму индукции.

Широкая субстратная специфичность. Изоформы Р₄₅₀

К настоящему времени описано около 150 генов цитохрома Р₄₅₀, кодирующих различные изоформы фермента. Каждая из изоформ Р₄₅₀ имеет много субстратов. Этими субстратами могут быть как эндогенные липофильные вещества, модификация которых входит в путь нормального метаболизма этих соединений, так и гидрофобные ксенобиотики, в том числе лекарства. Определённые изоформы цитохрома

Р₄₅₀ участвуют в метаболизме низкомолекуляр- к классу трансфераз. Они характеризуются ши-ных соединений, таких как этанол и ацетон. рокой субстратной специфичностью.

Регуляция активности микросомальной системы окисления

Регуляция активности микросомальной системы осуществляется на уровне транскрипции или посттранскрипционных изменений. Индукция синтеза позволяет увеличить количество ферментов в ответ на поступление или образование в организме веществ, выведение которых невозможно без участия системы микросомаль-ного окисления.

В настоящее время описано более 250 химических соединений, вызывающих индукцию микросомальных ферментов. К числу этих индукторов относят барбитураты, полицикличес-кие ароматические углеводороды, спирты, ке-тоны и некоторые стероиды. Несмотря на разнообразие химического строения, все индукторы имеют ряд общих признаков; их относят к числу липофильных соединений, и они служат субстратами для цитохрома Р₄₅₀.

Б. Конъюгация — вторая фаза обезвреживания веществ

Вторая фаза обезвреживания веществ — реакции конъюгации, в ходе которых происходит присоединение к функциональным группам, образующимся на первом этапе, других молекул или групп эндогенного происхождения, увеличивающих гидрофильность и уменьшающих токсичность ксенобиотиков (табл. 12-2).

Таблица 12-2.
Основные ферменты и метаболиты, участвующие в конъюгации

1. Участие трансфераз в реакциях конъюгации

Все ферменты, функционирующие во второй фазе обезвреживания ксенобиотиков, относят к классу трансфераз. Они характеризуется щирокой субстратной специфичностью.

УДФ-глюкуронилтрансферазы

Локализированные в основном в ЭР уридин-дифосфат (УДФ)-глюкуронилтрансферазы присоединяют остаток глюкуроновой кислоты к молекуле вещества, образованного в ходе микросомального окисления (рис. 12-4).

Рис. 12-4. Уридиндифосфоглюкуроновая кислота (УДФ-C₆H₉O₆)

В общем виде реакция с участием УДФ-глюкуронилтрансферазы записывается так:

ROH + УДФ-C₆H₉O₆ = RO-C₆H₉O₆+ УДФ.

Сульфотрансферазы

Цитоплазматические сульфотрансферазы катализируют реакцию конъюгации, в ходе которой остаток серной кислоты (-S03H) от З'-фос-фоаденозин-5'-фосфосульфата (ФАФС) присоединяется к фенолам, спиртам или аминокислотам (рис. 12-5).

Рис. 12-5.3'-Фосфоаденозин-5'-фосфосульфат(ФАФ-SO₃Н)

Реакция с участием сульфотрансферазы в общем виде записывается так:

ROH + ФАФ-SO₃H = RO-SO₃H + ФАФ.

Ферменты сульфотрансферазы и УДФ-глюку-ронилтрансферазы участвуют в обезвреживании ксенобиотиков, инактивации лекарств и эндогенных биологически активных соединений.

Глутатионтрансферазы

Особое место среди ферментов, участвующих в обезвреживании ксенобиотиков, инактивации нормальных метаболитов, лекарств, занимают глугатионтрансферазы (ГТ). Глутатионтрансферазы функционируют во всех тканях и играют важную роль в инактивации собственных метаболитов: некоторых стероидных гормонов, простагландинов, билирубина, жёлчных кислот, продуктов ПОЛ.

Известно множество изоформ ГТ с различной субстратной специфичностью. В клетке ГТ в основном локализованы в цитозоле, но имеются варианты ферментов в ядре и митохондриях. Для работы ГТ требуется глутатион (GSH) (рис. 12-6).

Рис. 12-6. Глутатион (GSH)

Глутатион — трипептид Глу-Цис-Гли (остаток глутаминовой кислоты присоединён к цис-теину карбоксильной группой радикала). ГТ обладают широкой специфичностью к субстратам, общее количество которых превышает 3000. ГТ связывают очень многие гидрофобные вещества и инактивируют их, но химической модификации с участием глутатиона подвергаются только те, которые имеют полярную группу. То есть субстратами служат вещества, которые, с одной стороны, имеют элекгрофильный центр (например, ОН-группу), а с другой стороны — гидрофобные зоны. Обезвреживание, т.е. химическая модификация ксенобиотиков с участием ГТ, может осуществляться тремя различными способами:

• путём конъюгации субстрата R с глутатио-ном (GSH):

  R + GSH ⇒ GSRH,

• в результате нуклеофильного замещения:

  RX + GSH ⇒ GSR + НХ,

• восстановления органических пероксидов до спиртов:

  R-HC-O-OH + 2 GSH ⇒ R-HC-OH + GSSG + Н₂О.

  В реакции: ООН — гидропероксидная группа, GSSG — окисленный глутатион.

Система обезвреживания с участием ГТ и глутатиона играет уникальную роль в формировании резистентности организма к самым различным воздействиям и является наиболее важным защитным механизмом клетки. В ходе биотрансформации некоторых ксенобиотиков под действием ГТ образуются тиоэфиры (конъюгаты RSG), которые затем превращаются в меркаптаны, среди которых обнаружены токсические продукты. Но конъюгаты GSH с большинством ксенобиотиков менее реакционно-способны и более гидрофильны, чем исходные вещества, а поэтому менее токсичны и легче выводятся из организма (рис. 12-7).

Рис. 12-7. Обезвреживание 1-хлор, 2,4-динитробензола с участием глутатиона

ГТ своими гидрофобными центрами могут нековалентно связывать огромное количество липофильных соединений (физическое обезвреживание), предотвращая их внедрение в липидный слой мембран и нарушение функций клетки. Поэтому ГТ иногда называют внутриклеточным альбумином.

ГТ могут ковалентно связывать ксенобиотики, являющиеся сильными электролитами. Присоединение таких веществ — «самоубийство» для ГТ, но дополнительный защитный механизм для клетки.

Ацетилтрансферазы, метилтрансферазы

Ацетилтрансферазы катализируют реакции конъюгации — переноса ацетильного остатка от ацетил-КоА на азот группы —SO₂NH₂, например в составе сульфаниламидов. Мембранные и цитоплазматические метилтрансферазы с участием SAM метилируют группы -Р=O, -NH₂ и SH-группы ксенобиотиков.

2. Роль эпоксидгидролаз в образовании диолов

Во второй фазе обезвреживания (реакции конъюгации) принимают участие и некоторые другие ферменты. Эпоксидгидролаза (эпоксид-гидратаза) присоединяет воду к эпоксидам бензола, бензпирена и другим полициклическим углеводородам, образованным в ходе первой фазы обезвреживания, и превращает их в дио-лы (рис. 12-8). Эпоксиды, образовавшиеся при микросомальном окислении, являются канцерогенами. Они обладают высокой химической активностью и могут участвовать в реакциях неферментативного алкилирования ДНК, РНК, белков (см. раздел 16). Химические модификации этих молекул могут привести к перерождению нормальной клетки в опухолевую.

Рис. 12-8. Обезвреживание бензантрацена. Е₁ — фермент микросомальной системы; Е₂ — эпоксидгидратаза

В. Гниение аминокислот в кишечнике. Обезвреживание и выведение продуктов гниения из организма

Аминокислоты, невсосавшиеся в клетки кишечника, используются микрофлорой толстой кишки в качестве питательных веществ. Ферменты бактерий расщепляют аминокислоты и превращают их в амины, фенолы, индол, скатол, сероводород и другие ядовитые для организма соединения. Этот процесс иногда называют гниением белков в кишечнике. В основе гниения лежат реакции декарбоксилирования и дезаминирования аминокислот.

Образование и обезвреживание п-крезола и фенола

Под действием ферментов бактерий из аминокислоты тирозина могут образовываться фенол и крезол путём разрушения боковых цепей аминокислот микробами (рис. 12-9).

Рис. 12-9. Катаболизм тирозина под действием бактерий. Е — бактериальные ферменты

Всосавшиеся продукты по воротной вене поступают в печень, где обезвреживание фенола и крезола может происходить путём конъюгации с сернокислотным остатком (ФАФС) или с глюкуроновой кислотой в составе УДФ-глюку-роната. Реакции конъюгации фенола и крезола с ФАФС катализирует фермент сульфотрансфе-раза (рис. 12-10).

Рис. 12-10. Конъюгация фенола и крезола с ФАФС. Е — сульфотрансфераза

Конъюгация глюкуроновых кислот с фенолом и крезолом происходит при участии фермента УДФ-глюкуронилтрансферазы (рис. 12-11). Продукты конъюгации хорошо растворимы в воде и выводятся с мочой через почки. Повышение количества конъюгатов глюкуроновой кислоты с фенолом и крезолом обнаруживают в моче при увеличении продуктов гниения белков в кишечнике.

Рис. 12-11. Участие УДФ-глюкуронилтрансферазы в обезвреживании крезола и фенола. Е — УДФ-глюкуронилтрансфераза

Образование и обезвреживание индола и скатола

В кишечнике из аминокислоты триптофана микроорганизмы образуют индол и скатол. Бактерии разрушают боковую цепь триптофана, оставляя нетронутой кольцевую структуру.

Индол образуется в результате отщепления бактериями боковой цепи, возможно, в виде серина или аланина (рис. 12-12).

Рис. 12-12. Катаболизм триптофана под действием бактерий. Е — бактериальные ферменты

Скатол и индол обезвреживаются в печени в 2 этапа. Сначала в результате микросомального окисления они приобретают гидроксильную группу. Так, индол переходит в индоксил, а затем вступает в реакцию конъюгации с ФАФС, образуя индоксилсерную кислоту, калиевая соль которой получила название животного индика-на (рис. 12-13).

Рис. 12-13. Участие сульфотрансферазы в обезвреживании индола. Е — сульфотрансфераза

Обезвреживание бензойной кислоты

Синтез гиппуровой кислоты из бензойной кислоты и глицина протекает у человека и большинства животных преимущественно в печени (рис. 12-14). Скорость этой реакции отражает функциональное состояние печени.

Рис. 12-14. Образование гиппуровой кислоты из бензойной кислоты и глицина. Е — глицинтрансфераза

В клинической практике используют определение скорости образования и выведения гиппуровой кислоты после введения в организм ксенобиотика бензойной кислоты (бензойнокислого натрия) — проба Квика.

Г. Связывание, транспорт и выведение ксенобиотиков

В плазме крови множество как эндогенных, так и экзогенных липофильных веществ транспортируются альбумином и другими белками.

Альбумин — основной белок плазмы крови, связывающий различные гидрофобные вещества. Он может функционировать в качестве белка-переносчика билирубина, ксенобиотиков, лекарственных веществ.

Помимо альбуминов, ксенобиотики могут транспортироваться по крови в составе липопро-теинов, а также в комплексе с кислым а,-гликопротеином. Особенность этого гликопротеина состоит в том, что он является индуцируемым белком, участвующим в ответной реакции организма на изменения, происходящие в состоянии стресса, например, при инфаркте миокарда, воспалительных процессах; его количество в плазме увеличивается наряду с другими протеинами. Связывая ксенобиотики, кислый α₁-гликопротеин инактивирует их и переносит в печень, где комплекс с белком распадается, и чужеродные вещества обезвреживаются и выводятся из организма.

Участие Р-гликопротеина в выведении ксенобиотиков

Очень важный механизм выведения из клетки гидрофобных ксенобиотиков — функционирование Р-гликопротеина (транспортная АТФ-аза). Р-гликопротеин — фосфогликопротеин с молекулярной массой 170 кД, присутствующий в плазматической мембране клеток многих тканей, в частности почек и кишечника. Полипептидная цепь этого белка содержит 1280 аминокислотных остатков, образуя 12 трансмембранных доменов и два АТФ-связы-вающих центра (рис. 12-15). В норме его функция состоит в экскреции ионов хлора и гидрофобных токсичных соединений из клеток.

Рис. 12-15. Строение Р-гликопротеина. Р-гликопротеин — интегральный белок, имеющий 12 трансмембранных доменов, пронизывающих бислой цитоплазматической мембраны. N- и С-концы белка обращены в цитозоль. Участки Р-гликопротеина на наружной поверхности мембраны гликозилированы. Область между шестым и седьмым доменами имеет центры для присоединения АТФ и аутофосфорилирования

Когда гидрофобное вещество (например, противоопухолевое лекарство) проникает в клетку, то оно удаляется из неё Р-гликопротеином с затратой энергии (рис. 12-16). Уменьшение количества лекарства в клетке снижает эффективность его применения при химиотерапии онкологических заболеваний.

Рис. 12-16. Функционирование Р-гликопротеина. Заштрихованный овал — противоопухолевое лекарство (гидрофобное вещество)

Д. Индукция защитных систем

Многие ферменты, участвующие в первой и второй фазе обезвреживания, — индуцируемые белки. Ещё в древности царь Митридат знал, что если систематически принимать небольшие дозы яда, можно избежать острого отравления. «Эффект Митридата» основан на индукции определённых защитных систем (табл. 12-3).

Таблица 12-3.
Индукция систем, обеспечивающих защиту от ксенобиотиков

В мембранах ЭР печени цитохрома Р₄₅₀ содержится больше (20%), чем других мембраносвязанных ферментов. Лекарственное вещество фенобарбитал активирует синтез цитохрома Р₄₅₀, УДФ-глюкуронилтрансферазы и эпоксид гид-ролазы. Например, у животных, которым вводили индуктор фенобарбитал, увеличивается площадь мембран ЭР, которая достигает 90% всех мембранных структур клетки, и, как следствие, — увеличение количества ферментов, участвующих в обезвреживании ксенобиотиков или токсических веществ эндогенного происхождения.

При химиотерапии злокачественных процессов начальная эффективность лекарства часто постепенно падает. Более того, развивается множественная лекарственная устойчивость, т.е. устойчивость не только к этому лечебному препарату, но и целому ряду других лекарств. Это происходит потому, что противоопухолевые лекарства индуцируют синтез Р-гликопротеина, глутатионтрансферазы и глутатиона. Использование веществ, ингибирующих или активирующих синтез Р-гликопротеина, а также ферменты синтеза глутатиона, повышает эффективность химиотерапии.

Металлы являются индукторами синтеза глутатиона и низкомолекулярного белка металлотионеина, имеющих SH-группы, способные связывать их. В результате возрастает устойчивость клеток организма к ядам и лекарствам.

Повышение количества глутатионтрансфераз увеличивает способность организма приспосабливаться к возрастающему загрязнению внешней среды. Индукцией фермента объясняют отсутствие антиканцерогенного эффекта при применении ряда лекарственных веществ. Кроме того, индукторы синтеза глутатионтрансфе-разы — нормальные метаболиты — половые гормоны, йодтиронины и кортизол. Катехоламины через аденилатциклазную систему фос-форилируют глутатионтрансферазу и повышают её активность.

Ряд веществ, в том числе и лекарств (например, тяжёлые металлы, полифенолы, S-алкилы глутатиона, некоторые гербициды), ингибируют глутатионтрансферазу.