Учебник для ВУЗОВ

БИОХИМИЯ

Б. Идентификация специфических последовательностей

При обработке геномной эукариотической ДНК, в частности, ДНК человека, рестриктазами образуется так много фрагментов различной длины, что их не удаётся удовлетворительно разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле. После электрофореза рестрикцированной геномной ДНК и проявления с помощью бромида этидия получается равномерное окрашивание по всей длине геля. Идентификация нужных фрагментов ДНК в таком геле возможна только путём гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Синтез ДНК-зондов осуществляется в автоматизированных машинах, позволяющих синтезировать фрагменты однонитевой ДНК длиной свыше 100 нуклеотидных звеньев со строго определённой первичной структурой. Такие молекулы можно использовать для специфического связывания с исследуемыми участками гена.

Блот-гибридизация по Саузерну

Классическим методом идентификации интересующих участков ДНК стал метод блот-гибридизации по Саузерну, предложенный в 1975 г. Суть метода заключается в том, что сплошная «лестница» фрагментов ДНК, получившаяся в результате их деления по молекулярной массе в гелях, подвергается денатурации и переносится с геля на плотный носитель (нитроцеллю-лозный фильтр или нейлоновую мембрану). Перенос, или блотгинг, осуществляется за счёт капиллярных сил, электрического поля или вакуума (рис. 4-63). Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с ДНК- или РНК-зондом, содержащим метку. Методом радиоавтографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридизация — высокочувствительный метод идентификации специфических последовательностей.

Рис. 4-63. Блот-гибридизация по Саузерну. Фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза, денатурируют, переносят на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизуют с ДНК-зондом

К настоящему времени разработано много модификаций этого метода. Так, ДНК-зонд не всегда метят радиоактивными изотопами, нередко используют соединения, ковалентно связывающиеся с ДНК; их можно обнаружить по образованию окрашенного продукта или флюоресценции. Длина олигонуклеотидов в ДНК-зондах также может сильно варьировать, будучи иногда очень короткой — в 15—20 пар нуклеотидов. Описаны методы дот- (пятно) или слот- (полоска) гибридизации, когда на твёрдый носитель наносят препараты ДНК или РНК без предварительной рестрикции или электрофореза и гибридизуют их с мечеными ДНК-зондами.